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蛋白實驗常見問題

發布者:莊盟生物發布時間:2015-04-09瀏覽次數:2829次

1、蛋白樣品不能反復凍融;

2、蛋白樣品應加蛋白酶抑制劑,以增加蛋白的穩定性(建議最好能多加幾中種蛋白酶抑制劑,具體細節請聯系本公司技術人員);

3、細胞水平要做Western Blot,一般地5×106個細胞提取的蛋白夠就足Western Blot;

4、如果目標蛋白是膜蛋白和胞漿蛋白,所用的去垢劑就要溫和得多,建議提取后最好加上NaF去抑制磷酸化酶的活性;

5、若轉膜不完全,可以加大上樣量,還有轉移時你可以用降低電流延長時間,轉膜液中甲醇的比例多加5-10%;

6、如果上樣量超載,可以濃縮樣品,也可以根據你的目標分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地,超載30%是不會有問題的。如果已經超了不少了,而且小分子量的也要,可以考慮加大膠的厚度,可以試試1.5mm的 comb;

7、蛋白變性后,-80℃,一兩年沒有問題。最關鍵兩條:不要被蛋白酶水解掉;不要被細菌消化掉(也是被酶水解了);

8、脫脂奶粉中含生物素,如果實驗中有涉及到“生物素”請將封閉液改為BSA封閉;

9、做200kd以上蛋白的Western Blot時要注意,分離膠最好選擇>7%的;剝膠時要小心;轉移時間需要相應延長;要做分子量參照(否則出現雜帶不知道如何分析);

10、蛋白的上樣量要根據實驗的要求來定,如果要求是定量和半定量的Western Blot則上樣量要均等,如果只是要定性,則沒有太大的關系,盡量多上就行了,但是不要超過0.3μg/mm2;

11、一抗,二抗的比例是比較重要,調整好一抗,二抗的比例,可以去掉部分非特異的本底;12、免疫組化和Western Blot可以用同一種抗體嗎?

解答:免疫組化時抗體識別的是未經變性處理的抗原決定簇(又稱表位),有些表位是線性的,而有的屬于構象型;線性表位不受蛋白變性的影響,天然蛋白和煮后的蛋白都含有;構象型表位由于受蛋白空間結構限制,煮后變性會消失。如果你所用的抗體識別的是蛋白上連續的幾個氨基酸,也就是線性表位,那么這種抗體可同時用于免疫組化和Western,而如果抗體識別構象形表位,則只能用于免疫組化。一般抗體說明書上都有注明此種抗體識別的氨基酸區間。(限于單抗);

13、抗體工作溶液一般不主張儲存反復使用,但是如抗體比較珍貴,可反復使用2-3次。稀釋后應在2-3天內使用,4度保存,避免反復凍融;

14、NC膜 PVDF膜 尼龍膜的差異。

尼龍膜是較理想的核酸固相支持物,有多種類型;硝酸纖維素膜是目前應用最廣的一種固相支持物,價格最便宜;PVDF膜介于二者之間。

就結合能力而言:尼龍膜結合DNA和RNA能力可達480-600μg/cm2,可結合短至10bp的核酸片段;硝酸纖維素膜結合DNA和RNA能力可達80-100μg/cm2,對于200bp的核酸片段結合能力不強;PVDF膜結合DNA和RNA能力可達125-300μg/cm2。

就溫度適應性而言:尼龍膜經烘烤或紫外線照射后,核酸中的部分嘧啶堿基可與膜上的正電荷結合;硝酸纖維素膜依靠疏水性相互作用結合DNA,結合不牢固;PVDF膜結合牢固,耐高溫,特別適合于蛋白印跡。

就韌性而言:尼龍膜較強;硝酸纖維素膜較脆,易破碎;PVDF膜較強。

就重復性而言:尼龍膜可反復用于分子雜交,雜交后,探針分子可經堿變性被洗脫下來;硝酸纖維素膜不能重復使用;PVDF膜可以重復使用。

15、在做Western Blot時,PVDF膜用甲醇浸泡的目的。

PVDF膜用甲醇泡的目的是為了活化PVDF膜上面的正電基團,使它更容易跟帶負電的蛋白質結合,做小分子的蛋白轉移時多加甲醇也是這個目的。

16、膜、濾紙、膠大小有何講究?

解答:如果用的是半干法,順序為:陰極-濾紙-膠-膜-濾紙。濾紙的長寬分別比膠面小1-2mm,而膜的長寬分別比膠大1-2mm。絕對禁忌:上下兩層濾紙因為過大而相互接觸,這樣會短路,電流不會通過膠和濾紙。

17、電泳時Marker總跑不全所有條帶,即使用增大膠濃度仍不全?

檢查兩種緩沖液Tris-HCl(pH 8.8和 pH 6.8),有可能有長菌現現象,建議重配兩種緩沖液。

18、Western Blot染色的選擇

(1)陰離子染料是最常用的,特別是氨基黑,脫色快,背景低檢測極限可達到1.5μg,考馬斯亮藍雖然與氨基黑有相同的靈敏度,但脫色慢,背景高。麗春紅S和快綠在檢測后容易從蛋白質中除去 ,以便進行隨后的氨基酸分析。缺點是:溶劑系統的甲醇會引起硝化纖維素膜的皺縮或破壞。不能用于正電荷的膜。靈敏度低。

(2)膠體金,靈敏度高,檢測范圍可到pg級,但染色不穩定。

(3)生物素化靈敏度位于1、2之間,可用于任何一種膜。

19、轉膜液加甲醇的目的是什么?

加甲醇起著一定的固定作用,因為小分子蛋白質容易轉出去.(特別是在硝酸纖維素膜上,因為NC膜結合蛋白質的能力較弱)。

20、轉膜時何為濕法,何為半干法?

半干法和濕法轉移是兩種不同的轉移裝置下的轉移系統,將膜,膠,濾紙整個浸泡在buffer的Tank里轉移的,叫濕法;用濾紙吸buffer來做轉移體系的叫半干法。

21、為什么濃縮膠和分離膠的電壓不一致?同樣的電壓可以嗎?

濃縮膠的目的使得loading 的樣品能夠在同一條水平線上進入分離膠 ,如果電壓太大前端的蛋白容易在后面的蛋白趕上來前進入分離膠。而在分離的理論上(實際上也是)小電壓長時間分離的效果會更好,但是在操作過程中沒有必要等那么長的時間,所以就用大電壓快點跑。


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